Перейти в содержание Вестника РНЦРР МЗ РФ N3.

УДК 616-056.7:616-006.6

ИДЕНТИФИКАЦИЯ МУТАЦИЙ В ГЕНЕ BRCA1 У БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ САНКТ-ПЕТЕРБУРГА.

Н.А. Грудинина¹, В.И.Голубков¹, О.С. Тихомирова¹, Т.В.Брежнева¹, К.П.Хансон², В.Б. Васильев¹, М.Ю.Мандельштам¹*

Адрес документа для ссылки: http://vestnik.rncrr.ru/vestnik/v3/papers/grudin_v3.htm

¹Государственное учреждение Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН, 197376, Санкт-Петербург, ул. академика Павлова, 12; факс (812)2349489; e-mail: michail@MM13666.spb.edu; ²Hаучно-исследовательский институт онкологии имени профессора Н.Н.Петрова Минздрава России, 189646, Ленинградская область, пос. Песочный-2, Ленинградская ул., д.68; факс (812)5968947; e-mail:hanson@irion.spb.ru.

*Автор, ответственный за переписку

АННОТАЦИЯ

При исследовании гена BRCA1 у больных семейными формами рака молочной железы Санкт-Петербурга идентифицировано семь мутаций (5382insC, 2963del10, 3819del5, 3875del4, 2274insA, R1203X и E1250K) и три ДНК-полиморфизма (S694S, L771L и E1038G). Из числа найденных нами мутация 2963del10 является новой, не описанной в других странах мира. Две идентифицированные у больных Санкт-Петербурга мутации (5382insC и 3875del4) встречаются и у онкологических больных из других регионов Российской Федерации, остальные мутации до наших исследований в России найдены не были. Мутация 5382insC обнаружена в четырех семьях, а мутация 3819del5 у двух пробандов. Наши работы вместе с данными других исследователей убедительно свидетельствуют в пользу широкого распространения мутации 5382insC в Российской Федерации, что может быть связано с эффектом основателя.

Ключевые слова: BRCA1, мутация, наследственная предрасположенность, рак молочной железы, рак яичника, Санкт-Петербург, эффект основателя, 5382insC, 2963del10.

ВВЕДЕНИЕ

Наследуемые мутации в генах BRCA1 и BRCA2 существенно повышают риск развития рака у их носителей и обусловливают так называемые семейные формы рака молочной железы и яичника, когда в одной родословной обнаруживаются множественные случаи рака данной локализации [9]. Приблизительно 10% всех случаев рака молочной железы связаны с наследуемыми мутациями в генах BRCA1 и BRCA2. В мире интенсивно изучается спектр мутаций в генах BRCA-семейства, который сильно разнится между отдельными популяциями. Знание спектров мутаций, характерных для страны или региона, позволяет с помощью ДНК-диагностики выявлять группы риска развития заболевания. В России сведения о мутациях BRCA-генов сравнительно скудны [1, 2, 6, 7, 12], однако эти немногочисленные публикации позволяют рассматривать мутацию в гене BRCA1 5382insC как преобладающую в Российской популяции. В данной работе описываются результаты поиска мутации 5382insC у пробандов из 43 семей Санкт-Петербурга, отягощенных по раку молочной железы, а затем – мутаций 11-го экзона гена BRCA1.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Пациенты.

Пациенты с диагнозом «рак молочной железы» и семейной историей заболевания, то есть не менее чем с тремя случаями рака молочной железы и/или рака яичника в родословной, были отобраны для исследования врачами-генетиками НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова МЗ РФ (Санкт-Петербург). От всех пациентов было получено информированное согласие на исследование, после чего у них брали пробу венозной крови. Привлечение к анализу родственников производилось только после обнаружения мутации у пробанда.

Биохимические методы.

Выделение ДНК из лейкоцитов проводили после разрушения эритроцитов и получения фракции ядер [3, 8]. После обработки протеиназой К нуклеиновые кислоты очищали от белковых примесей фенол-хлороформными экстракциями. Для амплификации отдельных фрагментов гена BRCA1 использовали набор праймеров, синтезированных фирмой “Литех” (Москва) по опубликованным последовательностям [5]. Экзон 11 гена BRCA1 для амплификации был разбит на перекрывающиеся площадки, обозначенные последовательно буквами латинского алфавита как 11А-11Р [5]. ПЦР проводили с помощью реактивов фирмы “Медиген” (Новосибирск), изменяя для различных пар праймеров лишь температуру отжига [5]. Амплифицированные фрагменты ДНК анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле [11], ДНК окрашивали по окончании разделения серебром. Анализ конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов ДНК проводили в аппаратах с пластинами, погруженными в буфер для лучшего термостатирования. Клонирование амплифицированных фрагментов ДНК в линеаризованной плазмиде фирмы “Медиген” (Новосибирск) проводили согласно инструкциям изготовителя. Секвенирование ДНК проводили на аппарате ALF Express-2 (“Amersham Biosciences”) или ABI 377 (Applied Biosystems). Образец амплифицированной ДНК от гетерозиготного носителя мутации 5382insC был получен от доктора Ефрата Леви-Лахада (Ephrat Levy-Lahad) (Иерусалим, Израиль).

РЕЗУЛЬТАТЫ

В первую очередь мы осуществили поиск в группе из 43 онкологических больных мутации 5382insC в гене BRCA1, широко распространенной в европейских популяциях, и обнаружили ее в 4 семьях. Для идентификации этой мутации использовали метод гетеродуплексного анализа с применением в качестве положительного контроля фрагмента гена BRCA1 пациента с мутацией 5382insC. В дальнейшем исследовали экзон 11 гена BRCA1 у всех имеющихся пациентов на наличие вариантов нуклеотидной последовательности. Экзон 11 был выбран для начала анализа, потому что на его долю приходится больше двух третей всей кодирующей области гена, и подавляющее число разных мутаций обнаружено именно в этом экзоне [4]. Площадки, на которые был разбит экзон 11 (11A-11P), проверяли на наличие мутаций, анализируя конформационный полиморфизм однонитевых фрагментов ДНК (SSCP-анализ); в этих условиях эффективно выявлялись и гетеродуплексы (Рис. 1).

Рисунок 1. Идентификация мутаций в экзоне 11О гена BRCA1 с помощью анализа конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов ДНК.

Однонитевые конформеры ДНК отделяли от гомо- и гетеродуплексов в ходе электрофореза в 8% полиакриламидном геле при комнатной температуре. ДНК окрашена серебром.

Дорожки: 1,5 – ДНК от гетерозиготных носителей мутации 3819del5, 2 – образец с нормальной последовательностью, 3 – ДНК гетерозиготного носителя мутации E1250K, 4 – ДНК гетерозиготного носителя мутации 3875del4. На рисунке слева видны интенсивные зоны гомодуплексов (внизу), зоны гетеродуплексов и слабо прокрашивающиеся зоны однонитевых конформеров. Различие в картине распределения однонитевых конформеров для отдельных мутаций показано в левой части рисунка; в виде отдельных иллюстраций даны увеличенные участки с разделенными однонитевыми конформерами. Стрелками сбоку от врезок показаны дополнительные зоны однонитевых конформеров ДНК в сопоставлении с нормой.

Рис. 2. Наследование мутации 2963del10nt в 11 экзоне гена BRCA1, предрасполагающей к развитию рака молочной железы и яичника.

А. Родословная семьи с мутацией 2963del10nt в гене BRCA1. Пробанд, показана стрелкой, рак молочной железы диагностирован в 41 год. У сестры пробанда рак яичника выявлен в 52 года. Дочь пробанда, здорова в возрасте 19 лет. У всех трех найдена делеция 2963del10nt.

Б. Результаты секвенирования нормального (вверху) и мутантного (внизу) аллелей. В мутантном аллеле отсутствуют десять нуклеотидов (показаны прочерками).

При скрининге экзона 11J нами был обнаружен образец с типичными гетеродуплексами, который при электрофорезе ДНК в денатурирующих условиях давал две дискретные зоны, что позволяло предположить в одном из аллелей достаточно большую делецию. После клонирования мутантного аллеля и его секвенирования (Рис. 2) стало очевидно, что в нем отсутствуют 10 нуклеотидов. Эта мутация в соответствии с правилами номенклатуры была названа 2963 del10. При проведении семейного анализа эта делеция была обнаружена у сестры и у дочери пробанда. При анализе фрагмента 11O с помощью SSCP-анализа был выявлен целый ряд образцов с разными вариантами распределения фрагментов, отличающимися от нормального (Рис. 1). После стандартных процедур клонирования и секвенирования у двух неродственных пациенток была обнаружена однотипная делеция пяти нуклеотидов, обозначенная в соответствии с правилами номенклатуры как 3819del5, а у одной пациентки – четырехнуклеотидная делеция 3875del4. В том же экзоне SSCP-анализ позволил выявить одну нонсенс-мутацию R1203X и одну миссенс-мутацию E1250K. Наконец, еще одна однонуклеотидная инсерция 2274insA была выявлена в экзоне 11G. При скрининге остальных фрагментов экзона 11 мы выявили лишь широко распространенные варианты нуклеотидной последовательности гена BRCA1, известные как полиморфизмы ДНК. Полный список обнаруженных нами мутаций приведен в Таблице 1.

Таблица 1. Характеристика экзонных мутаций в гене BRCA1, найденных у больных раком молочной железы Санкт-Петербурга.

Экзон	Мутация	Эффект	Метод тестирования	Число семей (пациентов)	Примечание
20	5382insC	Сдвиг рамки	Гетеродуплексный анализ	4 (4)	Известная
11J	2963del10	Сдвиг рамки	Гетеродуплексный анализ	1(3)	Новая
11O	3819del5	Сдвиг рамки	Гетеродуплексный анализ	2 (2)	Известная
11O	3875del4	Сдвиг рамки	Гетеродуплексный анализ	1 (2)	Известная
11G	2274insA	Сдвиг рамки	Гетеродуплексный анализ	1 (1)	Известная
11O	R1203X	CGA>TGAc.3726C>T	SSCP-анализ	1 (2)	Известная
11O	E1250K	GAG>AAGc.3867 G>A	Гетеродуплексный анализ	1 (2)	Известная
11H	L771L	TTG>CTG c.2430 T>C	SSCP-анализ	Частый полиморфизм	Известный
11K2	E1038G	GAA>GGA c.3232 A>G	SSCP-анализ	Частый полиморфизм	Известный
11G	S694S	AGC>AGT c.2201C>T	SSCP-анализ	Частый полиморфизм	Известный

ОБСУЖДЕНИЕ.

В результате наших исследований мы идентифицировали 10 вариантов нуклеотидной последовательности гена, отличающихся от канонической последовательности (Таблица 1). Мы классифицировали 7 из них как мутации. Пять вариантов – делеции или инсерции (5382insC, 2963del10, 3819del5, 3875del4, 2274insA) – приводят к сдвигу рамки считывания и образованию кодона преждевременной терминации трансляции, а еще один (R1203X) является собственно нонсенс-мутацией. Мутации, вызывающие преждевременную терминацию, могут приводить к образованию нефункционального белка без BRCT повторов на его C-конце, важных для функционирования его как опухолевого супрессора [9]. Для ряда мутаций, в частности 3819del5 и 3875del4 показано, что мРНК, транскрибируемая с мутантного аллеля, содержащего терминирующий кодон, подвержена ускоренной деградации и практически не дает белкового продукта [10]. Для большинства идентифицированных мутаций накоплены эпидемиологические данные, свидетельствующие об их связи с развитием рака молочной железы [4]. Одна из мутаций – 2963del10 – была идентифицирована нами впервые в мире. Эта делеция также является мутацией сдвига рамки считывания и приводит к изменению аминокислотной последовательности белка. Начиная с 948-го аминокислотного остатка, последовательность белка оказывается измененной и обрывается из-за образования терминирующего кодона в позиции 999. В мире описано 14 мутаций, приводящих к возникновению стоп-кодона в той же позиции [4]. Эти мутации связаны с повышенным риском развития злокачественных опухолей [4], и поэтому мы сделали вывод о том, что и мутация 2963del10 также предрасполагает к развитию рака молочной железы и яичника (Рис. 2). Анализ ДНК родственников пациентки, несущей делецию 2963del10, показал, что данная мутация присутствует в последовательности ДНК сестры и дочери пробанда.

Миссенс-мутация E1250K была найдена у пациентки с семейной формой рака молочной железы, у которой опухоль была диагностирована в возрасте 64 лет. Аминокислотная замена отрицательно заряженной глутаминовой кислоты на положительно заряженный лизин в положении 1250 может повлиять на конформацию белка и, как следствие, привести к снижению его функциональной активности. К сожалению, в настоящее время не имеется прямых доказательств функциональной значимости замены, и в базах данных [4] она характеризуется как неклассифицированный вариант. Однако результаты тестирования родственников выявленного нами носителя мутации Е1250К свидетельствуют о ее возможной роли в развитии рака молочной железы, поскольку дочери пробанда, являющейся носителем той же мутации, диагноз рака молочной железы был поставлен в возрасте 39 лет.

Еще три варианта нуклеотидной последовательности (S694S, L771L и E1038G), найденные нами у пациентов с раком молочной железы из Санкт-Петербурга, были классифицированы на основании высокой частоты каждого из аллелей как полиморфизмы ДНК. База данных Breast Cancer Information Core (BIC) [4] рассматривает все эти варианты как не ассоциированные с заболеванием.

Таким образом, при исследовании 11-го и 20-го экзонов гена BRCA1 у 43 пациентов с семейными формами рака молочной железы мы обнаружили 10 различных вариантов нуклеотидной последовательности, отличающихся от канонической (GenBank, U14680). Семь из этих вариантов могут быть охарактеризованы как аллели, обусловливающие предрасположенность к раку молочной железы (5382insC, 2963del10, 3819del5, 3875del4, 2274insA, R1203X и E1250K). Три других варианта являются ранее описанными в мире полиморфизмами. Впервые в России обнаружено 5 мутаций, из них одна (2963del10) не была известна в других популяциях мира. Две найденные нами у больных Санкт-Петербурга мутации (5382insC и 3875del4) встречаются и в других регионах Российской Федерации [1, 7].

Идентификация мутаций важна не столько для заболевших раком пробандов, сколько для их родственников, у которых еще не возникли или не диагностированы опухоли. Внимательное отношение к состоянию молочной железы у родственниц пробандов с мутациями позволяет намного раньше выявить и удалить опухоль, что нередко спасает им жизнь. Мы обнаружили мутации в гене BRCA1 у дочерей пробандов в трех семьях и рекомендовали им консультацию онкологов.

Настоящее исследование было поддержано грантом РФФИ 01-04-49869 и грантом Совета по поддержке Ведущих научных школ России НШ-1730.2003.4. Авторы признательны д-ру Ефрату Леви-Лахад (Ephrat Levy-Lahad) (Иерусалим, Израиль) за предоставленные контрольные образцы ДНК для поиска часто встречающихся мутаций в гене BRCA1.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Карпухин А.В., Поспехова Н.И., Любченко Л.Н., Логинова А.Н., Хомич Е.В., Будилов А.В., Сергеев А.С., Захарьев В.М., Гарькавцева Р.Ф., Гинтер Е.К. Частоты однонуклеотидных полиморфизмов и мутаций в гене BRCA1 при наследственно обусловленном раке молочной железы и яичников// Доклады Академии наук. - 2002. - Т. 383. N 12. - С.706-709.

2. Мандельштам М.Ю., Голубков В.И., Ламбер Е.П., Шапиро И.М., Брежнева Т.В., Семиглазов В.Ф., Липовецкий Б.М., Хансон К.П., Гайцхоки В.С. Поиск часто встречающихся мутаций в генах предрасположенности к раку молочной железы// Генетика. - 2001. - Т. 31. N 12. - С.1681-1686.

3. Bell G.I., Karam J.H., Rutter W.J. Polymorphic DNA region adjacent to the 5' end of the human insulin gene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1981. - V.78. - P.5759-5763.

4. Breast Cancer Information Core (BIC). Доступен по URL: http://www.nhgri.nih.gov/Intramural_research/Lab_transfer/Bic/

5. Friedman L.S., Ostermeyer E.A., Szabo C.I., Dowd P., Lynch E.D., Rowell S.E., King M.-C. Confirmation of BRCA1 by analysis of germline mutations linked to breast and ovarian cancer in ten families // Nature Genetics. - 1994. - V. 8. - P.399-404.

6. Gayther S.A., Harrington P., Russell P., Kharkevich G., Garkavtseva R.F., Ponder B.A.J., and the UKCCCR Familial Ovarian Cancer Study Group. Rapid detection of regionally clustered germ-line BRCA1 mutations by multiplex heteroduplex analysis// Am. J. Hum. Genet. - 1996. - V. 58. - P.451-456.

7. Gayther S.A., Harrington P., Russell P., Kharkevich G., Garkavtseva R.F., Ponder B.A. Frequently occurring germ-line mutations of the BRCA1 gene in ovarian cancer families from Russia // Am. J. Hum. Genet. - 1997. - V. 60. N 5. - P.1239-1242.

8. Kunkel L.M., Smith K.D., Boyer S.H., Borgaonkar D.S., Wachtel S.S., Miller O.J., Breg W.R., Jones H.W., Rary J.M. Analysis of human Y-chromosome-specific reiterated DNA in chromosome variants // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1977. - V. 74. - P.1245-1249.

9. Online Mendelian Inheritance in Man. 113705*. Breast Cancer, Type 1; BRCA1

Доступен по URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=113705

10. Perrin-Vidoz L., Sinelnikova O.M., Stoppa-Lyonnet D., Lenoir G.M., Mazoyer S. The nonsense-mediated mRNA decay pathway triggers degradation of most BRCA1 mRNAs bearing premature termination codons // Hum. Mol. Genet. - 2002. - V. 11. N 23. - P.2805-2814.

11. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nd edn. - Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

12. Tereshenko I.V., Basham V.M., Ponder B.A.J., Pharoah P.D.P. BRCA1 and BRCA2 mutations in Russian familial breast cancer// Human Mutat. 2002. Mutation in Brief #479. Online. - P.1-3.